تختی در ۱۷ دی ۱۳۴۶ در اتاقش در هتل آتلانتیک تهران درگذشت. او دو روز قبل از مرگش یعنی ۱۵ دی، وصیت‌نامه اش را در دفترخانه اسناد رسمی شماره ۲۰۲ تحت شماره ۳۴۲۸ و با تعیین کاظم حسیبی به عنوان سرپرست فرزندش بابک (که تنها ۴ ماه داشت)؛ به ثبت رسانده بود. دربارهٔ دلایل مرگ او اختلاف نظرهای زیادی وجود دارد.

براساس اخبار منتشره در روزنامه‌های اطلاعات و کیهان ۱۸ دی ۱۳۴۶ غلامرضا تختی به خاطر وجود اختلافات خانوادگی با همسرش شهلا توکلی خودکشی کرده‌است. از انگیزه‌های ممکن برای خودکشی، مواردی چون ناکامی‌هایش در مسابقات در پایان عمر ورزشی تختی نام برده می‌شود. با این حال عده‌ای از دانشوران مرگ وی را مشکوک می‌دانند. این عقیده که ساواک او را به دلیل محبوبیت زیاد و عدم وفاداری به نظام وقت ایران به قتل رسانده‌است، در بین مردم وجود داشته‌است.غلامرضا تختی از سال ۱۳۴۲ بارها به ساواک احضار شد. اطرافیان شاه با ناکامی از نزدیک کردن او به دربار و حکومت، فشارها را بر تختی افزایش دادند. حتی در مواردی تختی از ورود به ورزشگاه‌ها منع می‌شد. او پس از دوری دوساله از رقابتهای ورزشی برای چهارمین بار در بازی‌های المپیک شرکت کرد و برای نخستین بار در این بازیها مدالی کسب نکرد. میرزایی با استناد به اسناد به جا مانده بیان می‌کند که ظاهراً حکومت میل داشت تختی بدون تمرین و آمادگی جسمی و روحی در میدان حاضر شود و با شکست خوردن، محبوبیتش در میان مردم را از دست بدهد. از سوی دیگر مردم نیز خواهان شرکت او در مسابقات جهانی بودند.

در چنین شرایطی تختی در سال ۱۳۴۵ هم در بازیهای جهانی تولیدو شرکت کرد و بار دیگر دست خالی به ایران بازگشت. جلال آل‌احمد دربارهٔ مرگ او چنین نوشت: «از آن همه جماعت هیچ‌کس، حتی برای یک لحظه، به احتمال خودکشی فکر نمی‌کرد.» عده‌ای معتقدند، تختی اگر خودکشی هم کرده باشد مسئولیت آن با حکومت شاه است که با فشارها و تنگناهایی که برایش به وجود آورد او را به این سمت سوق داد.

به گفته «پرویز عرب» از دوستان تختی در گفتگوی تفصیلی با ایسنا، وی خودکشی کرده‌است: «قرص آسپرین و تریاک را با هم مخلوط کرده بود و پس از ریختن در لیوان آب، آن را خورده بود. فجوری، رئیس پزشک قانونی وقت پس از معاینه تختی گفته بود بازوی راست تختی کبود بوده که دلیل آن هم این بود که او هنگام جان دادن با دندان بازوی خود را گاز گرفته بود».

پس از درگذشت تختی، جبهه ملی در بیانیه‌ای مرگ وی را خودکشی اعلام کرد.